Apakah tindak balas rantai polimerase (pcr)? fakta mengenai ujian, langkah & digunakan untuk

Apakah PCR (reaksi rantai polimerase)?

Reaksi rantai polimerase (PCR) adalah teknik yang digunakan untuk menguatkan jumlah DNA jejak (dan dalam sesetengah keadaan, RNA) yang terletak di atau di hampir sebarang cecair atau permukaan di mana helai DNA boleh disimpan. Kunci untuk memahami PCR adalah untuk mengetahui bahawa setiap manusia, haiwan, tumbuhan, parasit, bakteria, atau virus mengandungi bahan genetik seperti urutan DNA (atau RNA) (urutan nukleotida atau potongan DNA atau RNA) yang unik untuk spesies mereka, dan kepada individu spesies itu. Oleh itu, jika sampel mengandungi segmen DNA atau RNA, PCR adalah kaedah yang digunakan untuk menguatkan (membuat lebih banyak salinan yang serupa) dari urutan-urutan yang unik ini supaya ia dapat digunakan untuk menentukan dengan kebarangkalian yang sangat tinggi identiti sumber (a individu tertentu, haiwan, atau organisma patogen) DNA atau RNA jejak yang ditemui di atau di hampir mana-mana sampel bahan.

Walau bagaimanapun, amplifikasi PCR hanya sebahagian daripada ujian pengenalpastian. Sebaik sahaja penguatan dilakukan (lihat di bawah), segmen yang diperkuatkan perlu dibandingkan dengan segmen nukleotida lain dari sumber yang diketahui (sebagai contoh, individu tertentu, haiwan, atau organisma patogen). Perbandingan segmen unik ini sering dilakukan dengan meletakkan urutan nukleotida yang dijana oleh PCR di samping urutan nukleotida yang diketahui dari manusia, patogen, atau sumber lain dalam gel pemisah. Arus elektrik dijalankan melalui gel dan pelbagai urutan nukleotida membentuk band yang menyerupai "tangga" mengikut caj elektrik dan saiz molekulnya. Ini disebut elektroforesis gel. Band atau "tangga" seperti langkah-langkah yang berhijrah ke tahap yang sama dalam identiti gel menunjukkan urutan nukleotida. Kaedah ini adalah salah satu kaedah PCR yang paling popular diselesaikan (Lihat Rajah 1).

Gambar 1, Band atau "tangga" seperti langkah-langkah PCR menghasilkan DNA Mycobacterium (ihsan CDC)

Rajah. Unsur berulang (Rep) -PCR (A) dan gel electrophoresis gel medan (PFGE) (B) corak Mycobacterium cosmeticum mengasingkan daripada 2 pesakit di Ohio dan 1 pesakit di Venezuela. Rep-PCR dilakukan dengan menggunakan primer BOXA1R (3), dan PFGE dilakukan dengan enzim AsmeI sekatan. Lanes 1, 2, Ohio mengasingkan OH1 dan OH2; lorong 3, 4, kawalan tiub ATCC BAA-878T dan ATCC BAA-879; lorong 5, VZ1 mengasingkan Venezuela. Piawaian saiz DNA adalah 100-bp (S1) dan penanda 48.5-kb (S2).

Bagaimanakah tindak balas PCR (tindak balas rantai polimer) dilakukan?

Pada tahun 1983, Kary Mullis mendapati langkah asas untuk menguatkan urutan DNA. Beliau dan Michael Smith dianugerahkan Hadiah Nobel untuk membangunkan prosedur ini pada tahun 1993. Terdapat beberapa langkah asas yang diikuti dalam urutan; PCR boleh dilakukan dalam tiub tunggal dengan bahan kimia yang sesuai dan pemanas yang direka khas. Reagen atau bahan kimia yang diperlukan adalah seperti berikut:

• Contoh yang mengandungi urutan nukleotida (dari darah, rambut, nanah, mengikis kulit, dan sebagainya)
• Primer DNA: DNA tunggal terdalam pendek yang melekat pada urutan nukleotida yang menggalakkan sintesis sekumpulan nukleotida
• Polimerase DNA: satu enzim yang apabila DNA mempunyai terikat primer, turunkan segmen DNA yang melekatkan blok bangunan DNA untuk membentuk pasang asas pelengkap dan dengan itu mensintesis silikon nukleotida pelengkap DNA (pengenalan polimerase DNA tahan haba, Taq polimerase, yang berasal dari bakteria tahan panas, dengan ketara meningkatkan keupayaan untuk melaksanakan PCR)
• Sebilangan besar blok bangunan DNA yang dinamakan nukleotida (Adenine, Thymidine, Cytosine, dan Guanine, disingkat sebagai: A, T, C, dan G) hadir dalam larutan tersebut. Apabila blok ini dihubungkan bersama, mereka membentuk urutan nucleotide atau satu helai DNA. Apabila blok bangunan mengikat blok bangunan pelengkap mereka dengan ikatan hidrogen yang lemah (contohnya, A hanya akan ikatan dengan T dan G hanya dengan C) urutan nukleotida DNA pelengkap terbentuk dan terikat kepada DNA tunggal yang terdirus tunggal. Apabila pengikatan itu selesai, DNA sudu ganda pelengkap terbentuk dalam urutan tertentu.

PCR, kemudian, bermula dengan segmen DNA dari sampel yang diletakkan di dalam tiub dengan reagen yang disenaraikan di atas. Penyelesaian dipanaskan kepada sekurang-kurangnya 94 C (201.2 F); haba ini memecahkan ikatan hidrogen yang membolehkan helai DNA pelengkap terbentuk, jadi hanya helai tunggal dalam campuran (ini disebut denaturation DNA double-stranded).

Campuran dibiarkan sejuk hingga kira-kira 54 C (129.2 F). Pada suhu ini, primer DNA dan polimerase DNA mengikat DNA tunggal yang terkandas (ini disebut penyepuh DNA). Kerana blok bangunan lebih berlebihan (kepekatan tinggi) dalam campuran, polimerase menggunakannya untuk membuat helai DNA tambahan (disebut lanjutan DNA) dan proses ini lebih cepat pada 72 C (161.6 F). Proses ini menghasilkan molekul DNA dua strand yang baru dari setiap helai molekul asal.

Kitaran ini diulang kira-kira 40 kali dalam mesin yang disebut sebagai pemercik termal yang secara automatik mengulangi kitaran pendinginan pemanasan, dengan jumlah setiap urutan DNA berganda setiap kali kitaran penyejukan pemanasan selesai. Pada mulanya, segmen DNA tunggal boleh dikuatkan kepada kira-kira 100 bilion salinan selepas 40 kali ganda penggolongan.

Kenapa doktor memerintahkan ujian PCR (tindak balas rantai polimer)?

Ujian PCR membentuk asas beberapa ujian yang dapat menjawab banyak persoalan perubatan yang berbeza yang membantu para doktor mendiagnosis dan merawat pesakit. Sebagai contoh, ujian PCR boleh mengesan dan mengenal pasti organisma patogen pada pesakit, terutama yang sukar ditanam (misalnya, HIV dan virus lain dan kulat tertentu).

Doktor lain memerintahkan ujian PCR untuk membantu mendiagnosis penyakit genetik, sementara doktor lain menggunakan PCR untuk mengesan hubungan biologi seperti mengenal pasti ibu bapa kanak-kanak. Ujian PCR juga digunakan untuk mengenal pasti dan mencirikan mutasi genetik dan susunan semula yang terdapat pada kanser tertentu.

Walau bagaimanapun, ujian PCR telah diubah suai dan diperluaskan kepada banyak aspek penyelidikan saintifik termasuk biologi evolusi, cap jari genetik, penyiasatan forensik, dan banyak lagi.

Apakah RT-PCR?

RT-PCR adalah ujian PCR yang direka untuk mengesan dan mengukur RNA. Walaupun ujian PCR awal menguatkan DNA, banyak virus dan komponen biologi lain (misalnya, mitokondria) menggunakan RNA sebagai bahan genetik mereka. RT-PCR berbeza dari PCR konvensional dengan mengambil pertama RNA dan menukarkan untaian RNA ke dalam helai DNA. Ini dilakukan dengan dasarnya kaedah yang sama untuk PCR yang diterangkan di atas dengan pengecualian menggunakan enzim yang disebut transkripase terbalik dan bukannya polimerase DNA. Transkripase terbalik membolehkan satu helai RNA untuk diterjemahkan ke dalam satu helai silikon DNA. Apabila reaksi itu berlaku, kaedah PCR rutin boleh digunakan untuk menguatkan DNA. RT-PCR telah digunakan untuk mengesan dan mengkaji banyak virus RNA.

RT-PCR tidak sepatutnya dikelirukan dengan variasi lain PCR, yang dinamakan PCR Masa Nyata. PCR Masa Nyata adalah variasi PCR yang membolehkan analisis DNA diperkuat semasa 40 kitaran biasa. Walaupun prosedur ini mirip dengan PCR konvensional dengan berbasikal, PCR Real-Time menggunakan pewarna neon yang dilampirkan pada beberapa blok bangunan atau helai nukleotida kecil. Bergantung pada kaedah yang digunakan, pendarfluor terjadi apabila lembaran DNA yang diperkuat terbentuk. Jumlah pendarfluor boleh diukur sepanjang 40 kitaran dan membolehkan penyiasat mengukur produk tertentu dan jumlahnya semasa kitaran penguatan. Ini sering membolehkan penyiasat atau juruteknik makmal untuk melangkau elektroforesis gel atau prosedur menengah lain yang diperlukan untuk analisis produk PCR, sehingga menghasilkan lebih banyak keputusan yang pesat.

PCR masa nyata dan RT-PCR adalah variasi atau pengubahsuaian ujian PCR asal. Walau bagaimanapun, terdapat lebih banyak variasi (sekurang-kurangnya 25) yang wujud dan digunakan untuk menyelesaikan masalah tertentu. Mereka semua mempunyai nama yang berbeza seperti Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, PCR fasa pepejal dan banyak lagi.

PCR mungkin akan diubah suai untuk membantu menjawab sebarang soalan lain dalam bidang perubatan, biologi. dan bidang pengajian lain.